A colheita de material e o diagnóstico em Anatomia Patológica

            

Artigo da autoria de:

Justina Prada Oliveira, DVM, MsC, PhD

Isabel Cristina Ribeiro Pires, DVM, MsC, PhD

Departamento de Ciências Veterinárias da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

A Anatomia Patológica é a especialidade médico-veterinária responsável pela análise morfológica dos órgãos e tecidos com o intuito de contribuir para o diagnóstico, tratamento, prognóstico e até prevenção das doenças.

Garantir a precisão desses resultados é importante não só do ponto de vista de diagnóstico, mas também no intuito de impedir a frustração inerente de quando o esforço de recolha e envio de amostras não produz resultados interpretáveis. 

O sucesso do diagnóstico anatomopatológico depende de todos os intervenientes nos processos de recolha, preservação, envio e processamento do material. Assim, existem algumas regras de recolha de amostras que, ainda que bastante simples, quando não efectuadas correctamente podem inviabilizar o resultado final: o diagnóstico.

Sempre que possível, a lesão deve ser enviada na sua totalidade. Quando o tamanho desta não permitir o seu envio completo, a amostra deve ser representativa e incluir a transição entre a lesão e o tecido são, evitando as áreas de necrose ou hemorragia. No caso de biópsias de diferentes orgãos (fígado, rim, próstata...) obtidas por tru-cut, devem ser enviados 3 a 4 fragmentos, com 2 a 3 cm de comprimento total. No caso do gânglio linfático é preferível a biópsia incisional, que permite avaliação do parênquima e da cápsula do orgão.

A colheita e manipulação da amostra devem ser cuidadas. O corte deve ser preciso e efectuado de uma vez só, evitando-se a compressão dos tecidos. No caso de amostras de grandes dimensões dever-se-ão efectuar alguns cortes para permitir uma melhor fixação, sem, no entanto, individualizar por completo os fragmentos.

A fixação deverá ser imediata após a colheita. O material deve ser imerso em formol a 10%. Este obtêm-se diluindo-se 1 parte duma solução de formol comercial (a 40%) em 9 partes de água destilada.

As peças deverão ser introduzidas, sem qualquer esforço, em frascos de boca larga, que permitam fecho hermético, contendo previamente o fixador, que deve submergir completamente a peça. Poderá ser útil usar um pouco de gaze à superfície, em peças que flutuam, ou no fundo do frasco, para evitar que as peças colem ao mesmo.

O frasco contendo a amostra deverá ser identificado com tinta indelével e acompanhado pela informação clínica. Esta deverá incluir, não só a identificação do animal e do Médico Veterinário, mas também todos os dados considerados relevantes para o diagnóstico. A suspeita clínica é de suma importância, permitindo orientar a resposta de acordo com as suspeitas do médico veterinário.

A anatomia patológica pode ser de grande valor no estabelecimento de um diagnóstico, dependendo no entanto de um número de fatores que podem impossibilitar o mesmo. Ao patologista apenas é dada a ver uma pequena porção do animal, dependendo este da informação clínica e da correta manipulação do material para conseguir interpretar o mesmo e dar uma resposta útil para o clínico e para o animal.

Toxoplasmose: que análise pedir à INNO e como interpretar os resultados?

      
A INNO disponibiliza 4 tipos de análises para a Toxoplasmose: pesquisa de anticorpos policlonais, anticorpos IgM, anticorpos IgG e PCR.

A pesquisa de anticorpos policlonais é indicada para confirmar ou para descartar a presença da doença (pesquisa indiferenciada dos dois tipos de anticorpos IgG e IgM). A detecção de anticorpos policlonais é aconselhada em animais cujas proprietárias, não imunes à toxoplasmose, estão grávidas e que se apresentam à consulta para saber se os seus gatos constituem ou não um risco para a sua gravidez. Um gato seronegativo possui um maior risco em saúde pública, porque irá eliminar oocistos quando exposto pela primeira vez ao organismo. Os animais já expostos ao Toxoplasma e, portanto, imunizados, apresentam uma probabilidade de re-excreção muito baixa. A positividade do teste pode dever-se a anticorpos IgM (o que será raro em gatos saudáveis sem sinais clínicos), pelo que o animal deverá ser colocado em quarentena por um período de 1 a 3 semanas.

A pesquisa de anticorpos IgM é indicada para diagnóstico de infecção activa e na presença de sinais clínicos. Os anticorpos IgM são detectados a partir do 7º dia após infecção (PI) e começam a diminuir ao 20º dia PI.

A evidência de títulos de IgM ou um aumento de 4 vezes dos títulos de IgG ou IgA, pode significar uma infecção recente, mas não necessariamente eliminação de oocistos. Alguns gatos não desenvolvem títulos detectáveis de IgM e noutros estes títulos persistem durante meses ou anos após a infecção. Experimentalmente, detectaram-se títulos persistentes de IgM em gatos coinfectados com FIV ou sujeitos a corticoterapia ou com reexposição ao Toxoplasma.

A pesquisa de IgG é indicada para conhecer o estado de imunização do animal. Uma vez infectados, os animais apresentam quistos tecidulares durante o resto da vida, estimulando uma resposta imune humoral permanente e constante. 

Um gato seropositivo a IgG provavelmente não elimina oocistos e é menos provável que o faça se reexposto ou imunossuprimido. As recomendações são no sentido de evitar uma nova exposição a oocistos. 

Estudos demonstram que aproximadamente 80% dos gatos, experimentalmente inoculados com Toxoplasma, desenvolvem títulos detectáveis de IgM e 100% desenvolvem títulos detectáveis de IgG e IgA.

Vários anos após infecção experimental, podem ainda ser encontrados títulos de IgG maiores que 1:30000. Títulos persistentemente altos de IgG reflectem apenas a contínua presença do antigénio.

A INNO disponibiliza também PCR de Toxoplasma gondii em amostras biológicas (LCR, sangue EDTA, placenta, lavado brônquial e humor aquoso). É um teste muito sensível, no entanto, não permite a distinção entre infecção aguda ou infecção crónica subclínica em animais que apresentam quistos tecidulares.

Alterações à serologia de Leishmania pelo método ELISA

Desde Maio de 2012 as serologias realizadas na INNO para diagnóstico de Leishmania (ELISA) passaram a ser realizadas com o kit LEISCAN da Esteve Veterinária. As vantagens em termos de medidas de desempenho do método estão evidenciadas na tabela 1.

Utilizando como gold standard infecções experimentais e comprovação por PCR da positividade das amostras, o kit Leiscan demonstrou uma sensibilidade de 98%, o que equivale a ter a mais reduzida percentagem (2%) de falsos negativos quando comparado com outros kits ELISA. O método apresenta uma especificidade de 100%, o que significa que não apresenta falsos positivos; na prática clínica traduz-se na certeza de que um resultado positivo é sinónimo da presença de anticorpos anti-Leishmania (VPP=100%).

	Sensibilidade	Especificidade	Valor preditivo positivo	Valor preditivo negativo
LEISCAN	98%	100%	100%	93%
ELISA 1	78%	100%	100%	63%
ELISA 2	76%	100%	100%	68%

Tabela 1 - Comparação dos diferentes métodos ELISA para diagnóstico de Leishmaniose canina

O kit oferece a possibilidade de controlar o ensaio em três pontos distintos (controlo negativo, positivo baixo e positivo) contra os dois pontos tradicionalmente utilizados. Importa ainda referir que os resultados da serologia passaram a ser emitidos em valores de Rz (Razão da amostra), de acordo com uma fórmula que relaciona a absorvância da amostra com a absorvância do controlo positivo baixo.

A razão da amostra (Rz) tem equivalência com um determinado título de IFI, de acordo com a seguinte tabela.

Razão (Rz) da amostra	Resultado	Correspondência IFI
Rz < 0,5	Negativo	Negativo
0,5 < Rz < 0,7	Negativo	1/20 a 1/40
0,7 < Rz < 0,9	Negativo	1/40 a 1/80
0,9 < Rz < 1,1	Duvidoso	1/80
1,1 < Rz < 1,5	Positivo Baixo	1/80 a 1/160
1,5 < Rz < 2	Positivo Alto	1/160 a 1/320
2 < Rz <3	Positivo Alto	1/320 a 1/640
3 < Rz < 4	Positivo Muito Alto	1/640 a 1/1280
Rz >4	Positivo Muito Alto	> 1/1280

Tabela 2 - Equivalência entre razão (Rz) da amostra e título determinado por IFI

Os médicos veterinários continuam assim a dispor da mesma informação, mas que anteriormente era obtida pela realização das quatro titulações, com a vantagem do preço cobrado ser de apenas uma titulação. Deste modo deixam de existir as seguintes opções na tabela de preços: Leishmania Ac – 2 titulações (ELISA) e Leishmania Ac – 4 titulações (ELISA). 

Acreditamos que esta alteração na metodologia representa um salto qualitativo no diagnóstico da leishmaniose, indo de encontro às elevadas expectativas dos clínicos que confiam na INNO como o laboratório de referência para o diagnóstico desta doença com tão elevada prevalência em Portugal. 

Como sempre, a equipa técnica da INNO está disponível para qualquer esclarecimento adicional, bastando para tal contactar-nos através dos números habituais.

Coronavírus felino e peritonite infecciosa felina

A Peritonite Infecciosa Felina (PIF) é uma doença imunomediada fatal causada por estirpes mutantes do Coronavirus felino (FCoV). Ocorre em gatos domésticos e selvagens, geralmente com menos de 3 anos, sendo por isso uma das mais importantes causas de morte em animais jovens. Pensa-se que estas formas mutantes do FCoV não são libertadas via fecal, mas que estão contidas nas localizações anatómicas afetadas (nas efusões ou órgãos em caso de PIF seca). A mutação ocorre no gene 3c do vírus o qual codifica uma pequena proteína de função desconhecida; a perda deste gene não impede a replicação do vírus in vivo ou in vitro, no entanto, altera drasticamente o seu tropismo celular, inibindo a sua interiorização e replicação nos macrófagos.

A maioria dos gatos infectados com FCoV não desenvolve PIF. No geral, existem 4 possíveis desfechos após exposição ao vírus:

1. Apenas 5-10% desenvolvem PIF;
2. A maioria excretam o vírus via fecal durante um tempo, desenvolvem anticorpos e param a excreção ao mesmo tempo que o título de anticorpos volta a zero. 58% das excreções do vírus ocorre durante um mês e 95% duram menos de 9 meses;
3. 13% tornam-se portadores para toda a vida, excretando continuamente o vírus nas fezes. A maioria permanece saudável, enquanto que alguns desenvolvem diarreia crónica;
4. 4% dos gatos aparentam ser completamente resistentes à infecção por FCoV, não excretando o vírus e tendo uma quase indetectável titulação de anticorpos.

Não existe um teste único comercialmente disponível para diagnosticar PIF, sendo a imunohistoquímica de efusões ou lesões considerado o gold standard. Os diferentes testes disponíveis para ajudar ao diagnóstico de PIF incluem:

• Ac de FCoV no soro (especialmente útil em casos de PIF não efusivo, uma vez que apresentam títulos mais altos e são raramente negativos);
• RT-PCR de FCoV em sangue EDTA (aconselhado em PIF não efusivo e em fases febris) ou em líquidos de efusão (o indicado para PIF efusivo);
• Detecção de antigénio por imunohistoquímica em efusões ou tecidos biopsiados. Neste caso é necessária biópsia prévia para detectar as lesões com macrófagos infectados, sobre as quais se realizará a imunohistoquímica. As lesões de PIF não efusivo são frequentemente encontradas nos rins, linfonodos mesentéricos e, menos frequentemente, no fígado e linfonodos hepáticos;
• Alfa 1 glucoproteína ácida (em soro); apesar de ser não específica para PIF, é uma proteína de fase aguda que, em casos de PIF, é geralmente >1500ug/mL (valores que a permitem distinguir de outras condições não inflamatórias clinicamente semelhantes a PIF).

Os testes serológicos devem apenas ser realizados em conjunto com uma história clínica compatível com PIF e após a pesquisa na efusão ou sangue de globulinas aumentadas e rácio A:G baixo. Só deste modo, os testes serológicos são úteis para gatos com suspeita de PIF, no entanto, apresentam limitações. Em primeiro lugar, muitos gatos saudáveis ou com outras condições para além de PIF podem ser seropositivos (biotipo entérico do FCoV). Em segundo lugar, alguns gatos com PIF efusivo podem apresentar títulos baixos ou serem mesmo negativos, uma vez que a grande quantidade de vírus presente está ligada a anticorpos, não estando disponível para se ligar ao antigénio do teste serológico. Pelo que, gatos seronegativos com suspeita de PIF efusiva devem ser examinados para a presença do vírus na efusão através do método PCR.

Apesar de o título de anticorpos não ser capaz de predizer se o animal desenvolveu PIF, reflete, no entanto, a carga viral do animal. Alguns autores sugerem que quanto maior a carga viral, maior a possibilidade de ocorrerem as mutações responsáveis pelo desenvolvimento de PIF.

Autoaglutinação em gato

Por aglutinação entende-se a formação de agregados de eritrócitos em forma de cacho de uva e ocorre em sangue de animais com anemia imunomediada. A aglutinação em animais anémicos é um indicador do efeito mediado por anticorpos, no entanto, a sua ausência não permite excluir uma anemia imunomediada.

Ocasionalmente, a aglutinação pode ser observada macroscopicamente (ainda no tubo EDTA ou quando colocada numa lâmina, figura 1) ou microscopicamente (em preparações não coradas a sangue fresco ou no esfregaço sanguíneo, figuras 2, 3 e 4).

A forma mais fácil de comprovar a presença de aglutinação é verificar microscopicamente a fresco se os eritrócitos permanecem agrupados quando o sangue é sujeito a uma diluição de 1:1 com soro fisiológico.

As causas de anemia hemolítica imunomediada podem ser primárias (pouco frequente em gatos) ou secundárias a: FeLV, hemoparasitas, Sarcocystis spp., hemangiossarcoma, neoplasias hematopoiéticas, intoxicação por zinco, picadas de abelha, fármacos (penicilina, cefalosporinas, trimetropim-sulfametoxazol, levamisol e amiodarona), vacinas vivas modificadas e incompatibilidade em transfusões.

Figura 1 - Aglutinação macroscópica

Figura 2 - Sangue - exame a fresco, 200X

Figura 3 - Sangue - exame a fresco, 1000X

Figura 4 - Esfregaço, 200X (coloração Hemacolor®)

Corpos de Heinz e anemia por dano oxidativo

Os corpos de Heinz foram descritos pela primeira vez em 1890 como estruturas redondas em protusão na superfície dos eritrócitos de humanos e animais. Estas estruturas, que estão associadas a destruição eritrocitária, podem ser encontradas em várias espécies secundariamente a dano oxidativo. As causas mais frequentes de dano oxidativo nas espécies domésticas são a administração de acetaminofeno (Cão/Gato), ingestão de cebola (Cão/Gato) ou alho (Cão), ingestão de propilenoglicol (Gato) e de zinco (Cão). Estão ainda descritas outras causas de aparecimento de corpos de Heinz, tais como hipertiroidismo, linfoma, diabetes mellitus, administração de benzocaína, fenazopiridina, azul de metileno ou vitamina K.

Os corpos de Heinz podem ser identificados em esfregaços corados com colorações do tipo Romanowsky (figura 1), no entanto, a sua identificação fica particularmente facilitada em esfregaços corados com azul de metileno, tal como se pode ver na figura 2. As imagens pertencem a um gato siamês que realizou um hemograma com avaliação do esfregaço sanguíneo no Laboratório INNO.

Figura 1 - Corpos de Heinz corados com Diff-Quick aparecem como protuberâncias à superfície dos eritrócitos.

Figura 2 - Corpos de Heinz corados com novo azul de metileno aparecem como protuberâncias redondas escuras à superfície dos eritrócitos.

O laboratório como aliado nas doenças endócrinas!

* (E a desmistificação das mesmas)


Artigo da autoria de:
Pedro Morais de Almeida, DVM

Sem sintomas não há doença endócrina. Devemos ser criteriosos na escolha de testes endócrinos que pedimos ou mesmo pensar se fará sentido solicitá-los.

No diagnóstico de doenças endócrinas nem sempre o laboratório ou o que nos chega dele, parece ajudar. Muitos de nós já tivemos um paciente que tinha tudo para ser hipotiroideu mas o doseamento hormonal vem normal ou com resultados aparentemente discordantes. Outras vezes são as unidades dos doseamentos que vêm diferentes - pensamos em µg/ dL e vêm em nmol/L -,  intervalos de referência diferentes, conclusões de resultados com as quais nem sempre concordamos; em que tubos enviar, que quantidade, que acondicionamento… enfim muitas dúvidas.

E que teste escolher? Basta estudar com algum detalhe uma doença endócrina para rapidamente nos depararmos com uma panóplia de testes endócrinos. Escolher testes de triagem – triagem é um termo adoptado pela medicina da linguagem de competição automobilística - o que devemos retirar de uma análise dita de triagem tem  uma boa relação custo, praticabilidade, tempo de resposta e sensibilidade/ especificidade. São os testes a escolher numa primeira abordagem e são fiáveis.

Relembrando: sensibilidade é a capacidade de um teste em detectar um paciente com a doença endócrina e especificidade é a capacidade do teste em dar como negativo um animal sem doença. O ideal seria ter um teste 100% sensível e 100% específico. Os testes de triagem tem sensibilidades e especificidades altas.

Análises de triagem:  doseamento de TT4/ TSH no hipotiroidismo;  teste de estimulação com ACTH no hiperadrenocorticismo e hipoadrenocorticismo; TT4 no hipertiroidismo; cálcio ionizado nas hiper e hipocalcemias; IGF-1 na acromegalia e dwarfismo pituitário; aldosterona e renina sérica no hiperaldosteronismo; quociente insulina sérica/ glicose no insulinoma; prova de ADH (DDAVP) na diabetes insípidos; ecografia e pressão arterial em crise no feocromocitoma.

Relativamente à diabetes mellitus: o teste de estimulação com arginina IV usado em medicina humana,  tem elevada sensibilidade para provar a presença de função residual das células beta , mas não nos gatos! Em 2011 apareceu o primeiro  teste ELISA para insulina canina, mas ainda sem valores de referência canina... penso que estes 2 dados são suficientemente esclarecedores de como ante mortem  é impossível saber se há ou não células beta e se temos um diabético tipo I ou II. Em cães diabéticos, mesmo os infiltrados inflamatórios nos ilhéus pancreáticos e os anticorpos  anticélulas beta só aparecem em respectivamente 46% e 50%  dos casos.

Resumindo: cães terão diabetes tipo I (insulinodependentes);  gatos terão diabetes tipo II (insulinoindependentes embora 70% requeiram insulina numa fase inicial) os que  reverterem serão confirmadamente tipo II e os que não reverteram poderão ser tipo I ou II; cães e gatos com história de progestagéneos, glucocorticoides, acromegalia, hiperadrenocorticismo, pancreatite, diestro,  ou seja, doenças que comprovadamente estão associadas a insulinoresistência ou destruição de células beta terão diabetes mellitus tipo III.

Perante um animal muito suspeito de ter doença endócrina com valores normais de testes endócrinos de triagem,  a regra de uma forma geral é que: um valor normal na metade superior do intervalo de referência para doenças hiper e na metade inferior para doenças hipo, não descartam a doença. O que fazer? Testar novamente passadas algumas semanas ou pedir testes complementares.

Durante o tratamento é fundamental a realização de análises para uma monitorização adequada. Relativamente aos doseamentos hormonais a regra passa pelos hipo estarem no limite superior e os hiper no limite inferior de referência.

Os detalhes  importam na realização dos testes endócrinos. Muitas das hormonas respeitam o  ciclo circadiano, pelo que o seu doseamento deverá respeitar algumas regras, como a recolha  ser feita idealmente 4 a 6h após administração do fármaco, como no caso da levotiroxina ou trilostano; a administração de  dexametasona, em vez de metilprednisolona, na crise de hipoadrenocorticismo para não interferir com o teste de estimulação com  ACTH.

Há alterações orgânicas e medicações que interferem em muitos doseamentos hormonais. Devemos lembrar-nos disso, por exemplo, em azotémia, anemia, hemoconcentração, administração de glucocorticóides, fenobarbital,  sulfonamidas e anti-inflamatórios não esteróides.

Algumas raças têm valores fisiológicos fora do intervalo de referência, como o caso dos galgos, com as suas concentrações de hormonas tiroideias tradicionalmente baixas.

Como muitos colegas dizem: as hormonas são um mundo… mas depende de nós simplificá-lo! Realizar protocolos individuais por cada e para cada um de nós (só assim funcionam) para cada doença endócrina poderá ser um caminho.