Alterações à serologia de Leishmania pelo método ELISA

Desde Maio de 2012 as serologias realizadas na INNO para diagnóstico de Leishmania (ELISA) passaram a ser realizadas com o kit LEISCAN da Esteve Veterinária. As vantagens em termos de medidas de desempenho do método estão evidenciadas na tabela 1.

Utilizando como gold standard infecções experimentais e comprovação por PCR da positividade das amostras, o kit Leiscan demonstrou uma sensibilidade de 98%, o que equivale a ter a mais reduzida percentagem (2%) de falsos negativos quando comparado com outros kits ELISA. O método apresenta uma especificidade de 100%, o que significa que não apresenta falsos positivos; na prática clínica traduz-se na certeza de que um resultado positivo é sinónimo da presença de anticorpos anti-Leishmania (VPP=100%).

	Sensibilidade	Especificidade	Valor preditivo positivo	Valor preditivo negativo
LEISCAN	98%	100%	100%	93%
ELISA 1	78%	100%	100%	63%
ELISA 2	76%	100%	100%	68%

Tabela 1 - Comparação dos diferentes métodos ELISA para diagnóstico de Leishmaniose canina

O kit oferece a possibilidade de controlar o ensaio em três pontos distintos (controlo negativo, positivo baixo e positivo) contra os dois pontos tradicionalmente utilizados. Importa ainda referir que os resultados da serologia passaram a ser emitidos em valores de Rz (Razão da amostra), de acordo com uma fórmula que relaciona a absorvância da amostra com a absorvância do controlo positivo baixo.

A razão da amostra (Rz) tem equivalência com um determinado título de IFI, de acordo com a seguinte tabela.

Razão (Rz) da amostra	Resultado	Correspondência IFI
Rz < 0,5	Negativo	Negativo
0,5 < Rz < 0,7	Negativo	1/20 a 1/40
0,7 < Rz < 0,9	Negativo	1/40 a 1/80
0,9 < Rz < 1,1	Duvidoso	1/80
1,1 < Rz < 1,5	Positivo Baixo	1/80 a 1/160
1,5 < Rz < 2	Positivo Alto	1/160 a 1/320
2 < Rz <3	Positivo Alto	1/320 a 1/640
3 < Rz < 4	Positivo Muito Alto	1/640 a 1/1280
Rz >4	Positivo Muito Alto	> 1/1280

Tabela 2 - Equivalência entre razão (Rz) da amostra e título determinado por IFI

Os médicos veterinários continuam assim a dispor da mesma informação, mas que anteriormente era obtida pela realização das quatro titulações, com a vantagem do preço cobrado ser de apenas uma titulação. Deste modo deixam de existir as seguintes opções na tabela de preços: Leishmania Ac – 2 titulações (ELISA) e Leishmania Ac – 4 titulações (ELISA). 

Acreditamos que esta alteração na metodologia representa um salto qualitativo no diagnóstico da leishmaniose, indo de encontro às elevadas expectativas dos clínicos que confiam na INNO como o laboratório de referência para o diagnóstico desta doença com tão elevada prevalência em Portugal. 

Como sempre, a equipa técnica da INNO está disponível para qualquer esclarecimento adicional, bastando para tal contactar-nos através dos números habituais.

Coronavírus felino e peritonite infecciosa felina

A Peritonite Infecciosa Felina (PIF) é uma doença imunomediada fatal causada por estirpes mutantes do Coronavirus felino (FCoV). Ocorre em gatos domésticos e selvagens, geralmente com menos de 3 anos, sendo por isso uma das mais importantes causas de morte em animais jovens. Pensa-se que estas formas mutantes do FCoV não são libertadas via fecal, mas que estão contidas nas localizações anatómicas afetadas (nas efusões ou órgãos em caso de PIF seca). A mutação ocorre no gene 3c do vírus o qual codifica uma pequena proteína de função desconhecida; a perda deste gene não impede a replicação do vírus in vivo ou in vitro, no entanto, altera drasticamente o seu tropismo celular, inibindo a sua interiorização e replicação nos macrófagos.

A maioria dos gatos infectados com FCoV não desenvolve PIF. No geral, existem 4 possíveis desfechos após exposição ao vírus:

1. Apenas 5-10% desenvolvem PIF;
2. A maioria excretam o vírus via fecal durante um tempo, desenvolvem anticorpos e param a excreção ao mesmo tempo que o título de anticorpos volta a zero. 58% das excreções do vírus ocorre durante um mês e 95% duram menos de 9 meses;
3. 13% tornam-se portadores para toda a vida, excretando continuamente o vírus nas fezes. A maioria permanece saudável, enquanto que alguns desenvolvem diarreia crónica;
4. 4% dos gatos aparentam ser completamente resistentes à infecção por FCoV, não excretando o vírus e tendo uma quase indetectável titulação de anticorpos.

Não existe um teste único comercialmente disponível para diagnosticar PIF, sendo a imunohistoquímica de efusões ou lesões considerado o gold standard. Os diferentes testes disponíveis para ajudar ao diagnóstico de PIF incluem:

• Ac de FCoV no soro (especialmente útil em casos de PIF não efusivo, uma vez que apresentam títulos mais altos e são raramente negativos);
• RT-PCR de FCoV em sangue EDTA (aconselhado em PIF não efusivo e em fases febris) ou em líquidos de efusão (o indicado para PIF efusivo);
• Detecção de antigénio por imunohistoquímica em efusões ou tecidos biopsiados. Neste caso é necessária biópsia prévia para detectar as lesões com macrófagos infectados, sobre as quais se realizará a imunohistoquímica. As lesões de PIF não efusivo são frequentemente encontradas nos rins, linfonodos mesentéricos e, menos frequentemente, no fígado e linfonodos hepáticos;
• Alfa 1 glucoproteína ácida (em soro); apesar de ser não específica para PIF, é uma proteína de fase aguda que, em casos de PIF, é geralmente >1500ug/mL (valores que a permitem distinguir de outras condições não inflamatórias clinicamente semelhantes a PIF).

Os testes serológicos devem apenas ser realizados em conjunto com uma história clínica compatível com PIF e após a pesquisa na efusão ou sangue de globulinas aumentadas e rácio A:G baixo. Só deste modo, os testes serológicos são úteis para gatos com suspeita de PIF, no entanto, apresentam limitações. Em primeiro lugar, muitos gatos saudáveis ou com outras condições para além de PIF podem ser seropositivos (biotipo entérico do FCoV). Em segundo lugar, alguns gatos com PIF efusivo podem apresentar títulos baixos ou serem mesmo negativos, uma vez que a grande quantidade de vírus presente está ligada a anticorpos, não estando disponível para se ligar ao antigénio do teste serológico. Pelo que, gatos seronegativos com suspeita de PIF efusiva devem ser examinados para a presença do vírus na efusão através do método PCR.

Apesar de o título de anticorpos não ser capaz de predizer se o animal desenvolveu PIF, reflete, no entanto, a carga viral do animal. Alguns autores sugerem que quanto maior a carga viral, maior a possibilidade de ocorrerem as mutações responsáveis pelo desenvolvimento de PIF.

Autoaglutinação em gato

Por aglutinação entende-se a formação de agregados de eritrócitos em forma de cacho de uva e ocorre em sangue de animais com anemia imunomediada. A aglutinação em animais anémicos é um indicador do efeito mediado por anticorpos, no entanto, a sua ausência não permite excluir uma anemia imunomediada.

Ocasionalmente, a aglutinação pode ser observada macroscopicamente (ainda no tubo EDTA ou quando colocada numa lâmina, figura 1) ou microscopicamente (em preparações não coradas a sangue fresco ou no esfregaço sanguíneo, figuras 2, 3 e 4).

A forma mais fácil de comprovar a presença de aglutinação é verificar microscopicamente a fresco se os eritrócitos permanecem agrupados quando o sangue é sujeito a uma diluição de 1:1 com soro fisiológico.

As causas de anemia hemolítica imunomediada podem ser primárias (pouco frequente em gatos) ou secundárias a: FeLV, hemoparasitas, Sarcocystis spp., hemangiossarcoma, neoplasias hematopoiéticas, intoxicação por zinco, picadas de abelha, fármacos (penicilina, cefalosporinas, trimetropim-sulfametoxazol, levamisol e amiodarona), vacinas vivas modificadas e incompatibilidade em transfusões.

Figura 1 - Aglutinação macroscópica

Figura 2 - Sangue - exame a fresco, 200X

Figura 3 - Sangue - exame a fresco, 1000X

Figura 4 - Esfregaço, 200X (coloração Hemacolor®)

Corpos de Heinz e anemia por dano oxidativo

Os corpos de Heinz foram descritos pela primeira vez em 1890 como estruturas redondas em protusão na superfície dos eritrócitos de humanos e animais. Estas estruturas, que estão associadas a destruição eritrocitária, podem ser encontradas em várias espécies secundariamente a dano oxidativo. As causas mais frequentes de dano oxidativo nas espécies domésticas são a administração de acetaminofeno (Cão/Gato), ingestão de cebola (Cão/Gato) ou alho (Cão), ingestão de propilenoglicol (Gato) e de zinco (Cão). Estão ainda descritas outras causas de aparecimento de corpos de Heinz, tais como hipertiroidismo, linfoma, diabetes mellitus, administração de benzocaína, fenazopiridina, azul de metileno ou vitamina K.

Os corpos de Heinz podem ser identificados em esfregaços corados com colorações do tipo Romanowsky (figura 1), no entanto, a sua identificação fica particularmente facilitada em esfregaços corados com azul de metileno, tal como se pode ver na figura 2. As imagens pertencem a um gato siamês que realizou um hemograma com avaliação do esfregaço sanguíneo no Laboratório INNO.

Figura 1 - Corpos de Heinz corados com Diff-Quick aparecem como protuberâncias à superfície dos eritrócitos.

Figura 2 - Corpos de Heinz corados com novo azul de metileno aparecem como protuberâncias redondas escuras à superfície dos eritrócitos.